第二十七讲

  2019年11月22日,中国科学院上海药物研究所“药学前沿承嘏讲坛”第二十七讲在承嘏厅举行。北京大学药学院周德敏教授应邀作了题为“基于化学-生物学交叉驱动的药物源头创新”的专题报告。上海药物所学术委员会副主任柳红研究员主持报告会,药物所200余位科研人员和研究生参加了本次报告。

  周德敏教授从“中国制药如何腾飞”的思考开始,剖析了国际药物东京热APP下载安装场近十几年来的发展趋势,化学药逐渐被生物药取代,而原创药物的增长更强劲。美国制药业以基因泰克、吉利德为代表,近40年来发生巨大的变化,拉开了生物药时代的序幕,其成功的核心因素是“坚实的科学力量”和“娴熟的商业技艺”。面向健康中国2030目标,中国原创新药的研制任重而道远,他山之石值得借鉴。

  人体细胞是生物药的天然载体,它所含的近三万个基因,以及由此衍生出的数目和种类更多的功能性核酸、蛋白和糖等内源性大分子,因其固有的生物活性,成为生物药物的重要来源;而建立在这些内源性大分子基础之上的基因治疗、免疫/细胞治疗更是代表了精准医学的发展方向。周德敏分析了困扰内源性大分子成药、细胞/基因治疗的瓶颈问题——稳定性差、修饰难控,提出研究设想:通过建立定点修饰方法,让PEG化蛋白/ADC药物成为单一成分,可能会解决产品的质量控制问题;建立可控修饰方法,使T细胞条件性激活,使病毒载体靶向感染,那么困扰基因治疗和细胞治疗的瓶颈就有可能得到解决。由此,周德敏提出“内源性大分子精准修饰”的核心科学问题,通过建立包括核酸、蛋白质、多糖的精准修饰方法,大大提高大分子药物成药性,促进基因治疗、免疫治疗升级换代,实现生物药“源于自然,优于自然”的目标。相关研究获得基金委创新群体项目立项。

  介绍了研究目标后,周德敏教授首先回顾了10年前由他牵头的973项目“基于基因密码子拓展的蛋白质标记新方法”的工作,以及由此衍生的大量研究工作,介绍了相关研究进展。生命中心法则中,DNA转化成RNA,RNA翻译成蛋白,mRNA由61种编码子加3个终止密码子构成,核糖沿着mRNA滑动时,遇到一个三联码,就将相应的氨基酸引到这个位置上,遇到任何一个终止密码子,蛋白质翻译就停止了,核糖就解离下来。周德敏团队创造性地提出了一种改变生命中心法则的蛋白质定点标记新方法:在3个终止密码中选一个,使它不再是一个终止密码子,像61个编码子一样,作为一个新编码子,编码自然界中不存在、但可以人工合成的、有特定物理、化学、生物性质的非天然氨基酸,将非天然氨基酸引到相应位置上来。通过这种方法可以把任何感兴趣的发光氨基酸、磁性氨基酸等引入到目标蛋白的任意指定位点,赋予目标蛋白特殊的功能,用于研究信号通路的蛋白相互作用等,相关成果发表在Science和Nature系列杂志上。其中广泛应用于生命科学研究的非天然氨基酸是光交联氨基酸和把手氨基酸。例如,通过终止密码将把手氨基酸引入到蛋白质药物或蛋白质载体任意指定位点,再通过Click反应即可实现功能性分子与蛋白的定点偶联。

  周德敏教授接着介绍了蛋白定点修饰的拓展及转化工作,包括定点PEG化蛋白质药物,定点修饰ADC,定点RGD修饰病毒载体和PTC活病毒疫苗等。以蛋白质药物干扰素a-2b定点修饰为例,通过引入把手氨基酸,再通过Click反应,可以对干扰素进行任意指定位点、长度的PEG化,反应条件不依赖温度和PH,可以快速、定量、特异获得PEG化单体,借助构效关系研究实现活性优化,并通过不同长度的PEG化控制药物半衰期,为按需给药提供了新的策略。基于此定点化学修饰方法,可使东京热APP下载安装场上几乎所有蛋白药物快速更新换代,实现从异质向均一的跨越。针对ADC药物的定点偶联,借助非天然氨基酸定点标记方法,实现在抗体的任意指定位点引入细胞毒分子,如含放射性同位素的分子,通过抗体可靶向到肿瘤部位。将这种蛋白质定点修饰技术向病毒载体和活病毒拓展,可获得基因治疗用靶向病毒载体和活病毒疫苗。接着,周德敏基于这方面做了重点阐述。

  疫苗是当前预防病毒感染的重要手段。当前的病毒疫苗通常是亚单位疫苗,一旦病毒突变就无效了。病毒因感染人体诱发免疫反应具有疫苗的潜质,但病毒本身不能成为疫苗,是因为病毒感染、复制、突变,原先产生的免疫就无效了(即免疫逃逸)。设想如果能保留病毒的完整结构和感染力,仅剔除其在细胞内的复制能力,活病毒本身就可以成为疫苗。已知流感病毒包含8个基因片段,将含有这8个基因片段的病毒质粒转染到传统的包装细胞中,将产生病毒RNA和病毒蛋白,这些病毒成分聚集在一起产生子代病毒,这种子代病毒再次感染细胞进行大规模生产,这就是病毒传播。如果在病毒基因上人为地将某些基因位点的密码子修改为终止密码子,在常规细胞中,病毒RNA和病毒蛋白是不表达的,也就不能组装成新病毒。周德敏研究小组构建了含正交tRNA/pylRS的只有两个终止密码子并同时带有一个特殊绿色荧光蛋白(GFP)基因的另类细胞株,应用这个特殊的细胞株来包装病毒,获得了带终止密码子的活病毒,这种活病毒可感染正常细胞但不会复制。周德敏研究小组对PTC(Premature Termination Codon)病毒做了进一步的研究。通过PTC病毒全基因组优化实验,找到了高度保守不易突变的位点和容易突变的位点(如H蛋白、N蛋白),发现在流感病毒上同时引入4个终止密码子时,可大大降低突变返祖几率。动物实验表明,带有终止密码子的PTC病毒是安全的,并可预防野生型病毒感染。被PTC病毒免疫过的血液中,可以检测到各种体液免疫,也就是说,被非天然氨基酸标记的病毒的所有成分全部变为引发免疫反应的抗原,是一个全抗原疫苗。此外还能检测到粘膜免疫和T细胞免疫。用H1N1和H3N2病毒感染PTC病毒免疫的动物实验表明PTC病毒有交叉保护作用。此外,PTC病毒对达菲、金刚烷耐药的病毒有免疫保护作用。进一步研究发现,PTC病毒可以通过基因重组中和野生病毒,可成为治疗病毒的全新方法,研究小组正在对其机制进行深入研究。该成果在Science发表后,被给予了高度的评价:该方法是活病毒疫苗制备的通用方法,代表疫苗领域的革命,颠覆了病毒疫苗的理念,开辟了抗病毒药物新方向。该成果也被列为“2017年度中国科学十大进展”。

  周德敏研究工作的初衷和主要方向是基因治疗。基因治疗是将具有治疗作用的外源基因、shRNA、CRISPR等,借助于特殊介质(70%是病毒载体),导入含缺陷基因的细胞内,置换、修复或干预缺陷基因,从源头治疗疾病。病毒载体主要有慢病毒载体(RNA病毒载体)和腺相关病毒载体(DNA病毒载体)。目前病毒感染的非选择性和低效感染成为困扰基因治疗/病毒载体应用的主要科学问题。周德敏针对如何构建靶向选择性强、感染效率高而免疫原性低的病毒载体介绍了研究思路:将遗传密码扩展到包装细胞中,以便在载体表面的适当位置容易地引入把手氨基酸,然后通过点击化学,引入一个具有特定细胞取向性的配体,例如RGD(一个识别肿瘤细胞上整合素受体的短肽配体),这样,RGD栓系载体就可以通过RGD与整合素的特异性相互作用来识别整合素阳性的肿瘤细胞,实现靶向治疗。周教授团队建立了慢病毒载体定点修饰方法,通过非天然氨基酸,可以在病毒载体的膜蛋白任意位点做标记,通过Click反应,把病毒靶头引入膜蛋白的任意位点。通过此方法,可以实现慢病毒载体构效关系研究,由此设计出靶向整合素细胞的慢病毒载体,在慢病毒载体246位引入RGD时,带RGD的病毒载体感染含整合素受体细胞的选择性提高了10倍。通过对AAV病毒载体的定点修饰,对整合素受体细胞的感染选择性提高8倍,动物实验也证明可以选择性靶向到整合细胞。当携带治疗基因(HSV-TK自杀基因)时,发现GCV活性提高了30倍。这意味着可以把AAV病毒的用量减少10-30倍,用AAV病毒感染人体进行基因治疗产生的很多副作用就没有了。通过以上的研究工作,周德敏建立了基于靶向病毒载体的基因治疗平台,未来将拓展到溶瘤病毒、乙肝和HIV病毒等方向。

  他针对以上报告内容做了总结:围绕非天然氨基酸对蛋白质的修饰,通过建立位点可变、时空特异的修饰方法,对内源性大分子进行修饰,提高内源性大分子成药性,并改变基于内源性大分子机制的生物治疗方法(包括基因治疗和免疫治疗等)。随后,周德敏就“化学生物学驱动天然产物的药物创新”提出了思考,并重点梳理了五环三萜天然产物广谱抑制病毒感染的作用靶点和机制的研究工作。

  关于国粹中药/天然药物面临的困局,周德敏剖析了中药注射液因成分不清而发生严重不良反应,马兜铃酸强致癌性的发现敲响中药安全性的警钟。立足世界比较青蒿素和紫杉醇研究,青蒿素和紫杉醇都是天然产物成药的明星,青蒿素还获得了诺贝尔奖,但是,紫杉醇从发现、规模化制备、靶点研究、耐药到衍生物开发等各方面的研究故事清晰,仍是迄今为止最优秀的天然抗癌药物。反观青蒿素,同样起源于古人的古典名方,但是有关青蒿素最基础的作用靶点、耐药后的升级换代研究都没跟上,其中化学在传统中药研究中的缺位问题值得东京热APP下载安装药物化学家去思考。

  周德敏简单介绍了关于抗病毒药物的研发策略。病毒的生命过程,简言之分为进入、复制和释放。目前针对病毒复制的药物有很多,如HIV-“鸡尾疗法”;抑制病毒的释放的药物也已上东京热APP下载安装,如达菲;以病毒进入为靶构成了抗病毒药物研发新的契机,至今还没有小分子药物发现。病毒进入的本质其实就是病毒与宿主相互识别,核心是病毒膜蛋白与宿主膜蛋白的受体识别、结合进而融合的过程。病毒感染细胞具有狭窄的宿主性,比如流感病毒仅感染东京热APP下载安装的上呼吸道细胞,不感染肝细胞,也不感染免疫细胞,预示着其对宿主的识别可以被调控。核心问题就是,如何发现或者寻找到化学小分子,能够调控病毒-宿主膜蛋白的相互作用,从而抑制病毒-宿主的识别,改变病毒的宿主性。

  周德敏研究小组早期建立一系列携带荧光基因的假病毒(包括丙肝),建立了筛选模型。他们从广谱的抗病毒传统中药中发现,板蓝根、川续断、白薇等的中药粗提物阻挡丙肝病毒进入细胞的效果好,且安全无毒;随即展开了其抗病毒的物质基础研究,发现五环三萜是抗丙肝病毒的关键结构,并且有清晰的构效关系,其A、B、C、E环不能变,只能在D环上进行修饰。知其然,更要知其所以然。他们随即开展了五环三萜化合物抑制HCV感染的作用机制研究。其研究小组在五环三萜的可修饰位点引入生物素(Biotin),并用这个第一代探针做了钓鱼实验,很快找到与五环三萜发生相互作用的是丙肝病毒表面的膜蛋白E2,通过先导物结合E2阻断与受体CD81结合的验证实验,提出五环三萜抑制HCV感染的作用机制为:五环三萜结合在丙肝病毒的膜蛋白E2上,从而阻挡了它对宿主细胞-肝细胞表面的CD81受体的结合,从而改变了它的宿主性。

  周德敏又介绍了五环三萜抗流感病毒的构效关系研究,发现构效关系明确,从中找到了抗流感病毒的先导化合物Y3。五环三萜抑制流感病毒的表型分析显示,其抑制病毒对宿主的附着,不抑制细胞内复制。BIACORE实验发现,小分子作用在流感病毒膜蛋白上,与流感病毒膜蛋白上的H蛋白有很强的结合力,在小分子的存在下,HA蛋白与呼吸道上皮的唾液酸受体的结合力下降了100倍,揭示五环三萜抑制了流感病毒对呼吸道细胞的识别,改变了宿主性。用类似的实验和第三代光交联分子探针研究五环三萜对Ebola假病毒的作用机制,以及用核磁技术分析小分子和蛋白复合物的结构,发现五环三萜通过结合在Ebola病毒的膜蛋白HR2上,抑制了HR1和HR2的相互作用,阻止了病毒进入宿主细胞。HR1和HR2的相互作用广泛存在于各种病毒膜蛋白中,由此可推断:五环三萜天然产物抗病毒广谱性可能依赖于一个共性机制。未来,进一步验证将有助于揭开传统中药抗病毒的神秘面纱。

  我国中草药资源丰富,其中含有丰富且结构多样的酚类、多酚类、单宁类、萜烯类和生物碱等天然产物,均是长期生物进化和自然选择的结果。基于传统中草药所含的天然产物的化学生物学研究,有可能是探讨生命本质——我是谁、从哪里来、到哪里去,进而成为发现原创药物的途径!

  周德敏的报告内容新颖、层次分明,讲述清晰、重点突出,强调了学科交叉在创新药物研究中的重要性,并激励同学们做研究要打开思路、跳出传统观念的束缚,敢于探索新方法并努力实践,让与会师生受益匪浅。会后,研究人员就活体病毒疫苗等相关问题同他进行了热烈地探讨,柳红研究员为周德敏教授颁发了讲坛纪念证书。

  周德敏现为北京大学药学院院长、天然药物及仿生药物国家重点实验室主任;基金委创新群体牵头科学家、973 项目首席科学家、教育部长江学者特聘教授;美国化学会Molecular Pharmaceutics副主编、JMC、EJMC等杂志编委。主要从事基于化学-生物学交叉的新药发现,包括新型抗病毒小分子、蛋白质生物大分子药物、药物靶点/生物标志物发现与确证等。在Science、PNAS、Chem Rev、JACS、JMC、NAR等杂志发表论文80余篇,其中疫苗研究被 Science 杂志评为突破性进展。

  本期讲坛由上海药物所主办、新药研究国家重点实验室和中科院受体结构与功能重点实验室联合承办。

北京大学药学院周德敏教授做承嘏讲坛专题报告

承嘏讲坛专题报告会现场

柳红研究员为周德敏教授颁发承嘏讲坛纪念证书

  (供稿部门:新药研究国家重点实验室;供稿人:丁宁、李川)