第二十八讲

  2019年12月24日下午,中科院上海药物研究所“药学前沿承嘏讲坛”第二十八讲在承嘏厅举行。中国科学技术大学姚雪彪教授应邀作了题为“着丝粒动态组装与化学生物学”的专题报告。蒋华良院士主持报告会,百余位科研人员和研究生参加了本次报告。

  姚雪彪教授首先回顾了Barry J. Marshall和J. Robin Warren(2005年诺贝尔获奖者)发现胃炎和胃溃疡的真凶幽门螺杆菌及治疗方法的故事。姚教授早期也曾研究胃酸分泌与幽门螺杆菌效应的新机制,并一直关注和研究幽门螺杆菌的致病机制。1999年回到科大后,他提出“细胞动力学”设想,由此开始人类着丝粒蛋白质组分与细胞有丝分裂动力学机制研究,以及着丝粒动态组装与调控研究。细胞有丝分裂是维系生命个体健康与物种繁衍的重要保证,调控细胞命运抉择的着丝粒蛋白质机器通过动态组装与去组装决定子细胞的特征,即决定了一个细胞是走向增殖、分化还是死亡。同时在干细胞和肿瘤干细胞中还存在不对称分裂,但其具体机制还不完全清楚。在真核生物细胞周期中有2个重要环节,除了DNA和染色体复制,就是通过有丝分裂的5个细胞学状态将复制的遗传学信息一分为二。奠定真核细胞有丝分裂框架的3位科学家Paul、Tim&Lee于2002年获得诺贝尔奖。着丝粒是链接染色体和纺锤体的细胞器,表面附着很多微管(直径25nm),内层与DNA结合,含150余种蛋白质、20多种蛋白质机器。姚教授团队长期围绕着丝粒如何实现精准的组装与去组装以及着丝粒组装与去组装如何调控细胞命运抉择这两个关键问题开展研究。报告中,他列举了几个研究实例,包括:基于EB1发现微管正端跟踪蛋白Tip150,发现真核细胞中CDK1-Tip60-Aurora B这一信号轴及调控机制,发掘靶向着丝粒的小分子探针及化学生物学研究等。

  着丝粒表面附着的微管是动态的多聚体,其有规律的变化受能量调控,但因观察手段(1nm尺度)的缺乏,其中的动态机制还不太清楚。姚教授团队利用Shotgun蛋白质组学方法,捕获了一系列微管结合蛋白。其中,2008年发现EB1蛋白,这是一个结合在微管的末端三维结构上的保守蛋白,虽然仅有300多个氨基酸,但却承载了20多个蛋白质。EB1蛋白跟踪微管的生长,一系列正端追踪蛋白(MCAK、CLIP170等)结合在 EB1的尾部C端。2009年,他们又发现了一个全新的与 EB1结合的微管正端跟踪蛋白Tip150,可能辅助微管动态性调控。通过捕获EB1和乙酰转移酶PCAF之间的生化结合,发现PCAF介导了EB1蛋白尾部第220位赖氨酸(K220)的乙酰化。研究发现了有丝分裂的一种自身调控机制,乙酰化可以调控微管和着丝粒的紧密结合,使染色体在有丝分裂的中期通过微管紧密捕获着丝粒,保证染色质在中期可以顺利分开,而力量不足会导致机械感应的检验点激活质量控制,进而导致有丝分裂不会继续。在此基础上,他们利用光敏定位显微镜(PALM)技术,继续研究EB1的结构与功能相关性,捕获了单个氨基酸连接东京热APP下载安装域的赖氨酸对有丝分裂染色体稳定定位的影响。

  有丝分裂的驱动和完成不仅受磷酸化的调控,也被乙酰化和甲基化调控。姚教授团队针对乙酰转移酶Tip60蛋白,采取两种方法来确认其功能并研究与上下游通路的调控机制。一种是利用shRNA抑制蛋白质合成,使内源性降低后观察表型,看有丝分裂在哪个时期阻断的,为了避免脱靶现象,同时利用Tip60的小分子抑制剂NU9056进行验证。研究发现在有丝分裂的中期,Tip60对215位赖氨酸(K215)的乙酰化促进Aurora B的激酶活性;Tip60的90位丝氨酸是蛋白激酶CDK1的底物,对其磷酸化修饰定位在着丝粒上;Aurora B本身存在第232位苏氨酸(T232)的自磷酸化作用。对细胞有丝分裂中pS90-TIP60、acK215-Aurora B和pT232-Aurora B的时间动力学研究显示,Tip60的磷酸化修饰在前,Aurora B的自磷酸化和乙酰化修饰在后,提示Tip60的磷酸化修饰可能提高了Aurora B的活性,并通过酶学实验验证 CDK1磷酸化S90-Tip60促进Tip60的活性。以上研究发现了真核细胞中CDK1-Tip60-Aurora B这一信号轴,Aurora B监控微管和染色体之间衔接,Tip60对K215的乙酰化保护了 Aurora B免受 PP2A 介导的 T232去磷酸化作用,从而达到保证染色体的稳定性。一系列研究证明Tip60蛋白在有丝分裂中确实比较重要。他们利用质谱技术寻找到一系列Tip 60的底物,其中一个是G蛋白RAN(与施蕴瑜院士合作),RAN与另一个蛋白mog1的动态相互作用对染色体的精确分离至关重要,Tip60对第134位赖氨酸(k134)的乙酰化作用抑制了RAN与mog1的相互结合,使得RAN无法加载GTP,即把RAN锁定在GDP的状态,无法被RCC循环,从而抑制RAN的功能。

  姚教授接着介绍了有丝分裂重要调控蛋白的结构研究及化学小分子探针的发掘与应用。早期的研究曾发现马达蛋白CENP-E与Bubr1结合控制染色体分开,但对于Bubr1是否是激酶存在争议。姚教授与张荣光教授合作鉴定了果蝇Bubr1的三维晶体结构,发现其含有经典的激酶结构特征,提供了直接证据支持BubR1是蛋白激酶。与李林院士合作,利用天然植物单体库发现了一个新的Bubr1抑制剂,二萜类小分子化合物BRT-1,并以此为探针开展了一系列化学生物学实验,证明BRT-1确实能够干预Bubr1的功能,也证实了早期发现的马达蛋白CENP-E是Bubr1的底物,并找出了磷酸化位点(S2639)。重要的是,如果利用遗传学的方法干预内源性蛋白,看到的表型是一个慢性的时间累积的结果,不能东京热APP下载安装分蛋白在不同环节的功能,有了小分子干预,可以在有丝分裂中期(染色体分开的过程)加入小分子,从而验证调控蛋白在后期是否有功能。在有丝分裂中期加入 BRT-1,观察到后期中间纺锤体分叉而导致不对称分裂;在有丝分裂中期加入CENP-E小分子抑制剂,观察到同样的现象;通过电镜观察发现马达蛋白与微管的反平行构架在抑制剂干预下发生改变;CENP-E磷酸化后构象发生改变,通过在C段结合PRC1蛋白进行调控,有利于构建反平行构架。姚教授又介绍了正在开展的一部分工作的研究思路,由于胃的上皮细胞更新很快(14天左右),在细胞更新过程中,遗传学性状的不稳定性,是胃癌产生的重要特征,同时胃癌在全球范围还没有靶向药物。研究团队利用着丝粒模式体系和类器官模型研究蛋白质功能以及模拟胃癌的发生发展和小分子干预,从而为治疗药物的发现提供有效工具。

  姚雪彪教授的报告为与会人员带来了一场集细胞生物学、细胞动力学、蛋白质组学、化学生物学等多学科交叉的学术盛宴。会后,与会人员与姚教授进行了提问和交流,姚教授对研究生提出期望:围绕自己追踪的科学问题,要多思考,多读文献,不被技术瓶颈所限制;研究生阶段需要一些挫折,要守住初心,坚定信心,成功需要坚持。报告结束后,蒋华良院士为他颁发了讲坛纪念证书。

  姚雪彪,1995年毕业于美国加州大学伯克利分校获细胞分子生物学博士学位,现任中国科学技术大学教授,无膜细胞器与细胞动力学教育部重点实验室主任,教育部“长江计划”特聘教授,“国家自然科学杰出青年基金”获得者,作为负责人牵头科技部重点研发项目和基金委“创新群体项目”,兼任美国细胞生物学会国际事务部主任、中国细胞生物学会外事委员会主任等。

  本期讲坛由上海药物所主办、新药研究国家重点实验室和中科院受体结构与功能重点实验室联合承办。

中国科学技术大学姚雪彪教授作主题报告

报告现场

  蒋华良院士为姚雪彪教授颁发讲坛纪念证书

(供稿部门:中科院受体结构与功能重点实验室;供稿人:刘璐)